La electroforesis en gel de agarosa es un método de biología molecular para analizar y separar fragmentos de ADN basados en su tamaño. Cuando usas una electroforesis en gel para ayudarte en tus experimentos de clonación, es posible que puedas encontrar problemas muy comunes.

Por ejemplo, cuando estás listo para extraer el plásmido de ADN digerido del gel de agarosa, puedes ver más de una banda digerida en tu muestra y te preguntarás cuál deberías cortar. En este artículo, revisamos las diferentes formas de un plásmido de ADN y ofrecemos tips útiles para interpretar tu gel.


La Estructura de la Agarosa

La agarosa, producida de una alga marina, es un agar polisacárido. Durante la polimerización, los polímeros de agarosa se unen de forma no covalente y forman una red de paquetes. Esta red consiste de poros con unas propiedades de filtrado molecular.



Representación conceptual de un gel de agarosa a nivel microscópico

Representación conceptual de un gel de agarosa a nivel microscópico

La separación de ADN ocurre debido a la naturaleza tipo malla del gel de agarosa. Fragmentos más pequeños de ADN pueden moverse rápidamente a través de los poros, mientras los fragmentos más grandes son atrapados y por tanto viajan lentamente.

Demos una mirada a como funciona todo esto. Bajo un poderoso microscopio, un gel de agarosa lucirá poroso, pero al ojo humano, esto luce como una gelatina suave y opaca en forma de cuadrado con pozos cerca al final de la superficie. Un pozo es un bolsillo hueco en el gel donde el ADN es cargado o añadido. Debido a que la unidad de fosfato está cargada negativamente, el ADN tiene una ligera carga negativa que permite que la molécula migre al ánodo cargado positivamente. La distancia de viaje de las moléculas de ADN dentro de un gel de agarosa es proporcional al logaritmo de su peso molecular.




¿Cómo un Plásmido de ADN Circular Corre Durante una Electroforesis en Gel?

Las condiciones de la electroforesis en gel tales como la presencia de bromuro de etidio, la concentración en gel, la fuerza del campo eléctrico, la temperatura, y la fuerza iónica del buffer de electroforesis, pueden afectar la mobilidad del plásmido de ADN. Debido a la naturaleza similar a una red del gel de agarosa, un plásmido de ADN circular es atrapado más facilmente en la malla de agarosa.

ADN Circular, plasmido de ADN Circular corre durante una electroforesis en gel


El atrapamiento electroforético es un equilibrio entre la fuerza electroforética (el arrastre del ADN plasmídico circular en contra de la trampa) y la difusión (que permite que el ADN plasmídico circular escape de la trampa). Entonces, las moléculas de ADN circulares grandes tienen una mayor probabilidad de quedar atrapadas que el ADN más pequeño. El ADN superenrollado es más difícil de atrapar debido al pequeño tamaño del ADN retorcido.


ADN circular, ADN superenrollado



4 Formas Comunes del Plásmido de ADN

Monómero CCC (Círcular Cerrado Covalentemente)

Un mónomero CCC es un plásmido negativamente cargado y superenrollado. El plásmido intacto superenrollado tiene ADN compacto de doble hebra retorcido sobre sí mismo. El plásmido de ADN aislado de bacterias hospederas está usualmente presente en esta forma CCC. Adicionalmente, el plásmido de ADN no digerido es usualmente superenrollado.


Monómero CA (Circular Abierto)

Una forma circular abierta es causada por el corte de una cadena de ADN. La radiación UV o las nucleasas pueden causar que una cadena sencilla de ADN se rompa. Esta estructura es la forma más relajada y menos compacta del plásmido. Este plásmido también es menos superenrollado que la forma CCC.

4 formas comunes del plasmido de ADN


Monómero Linear

La forma lineal es un resultado del corte en ambas cadenas de ADN causado por endonucleasas de restricción.


Dímero Concatemero (OC)

Este dímero es una forma oligomérica del plásmido. El concatemero puede ocurrir debido a un proceso de replicación. Los dímeros son usualmente dobles en tamaño comparados a los monómeros.


Cómo interpretar los resultados de una electroforesis en gel de un plásmido de ADN

  1. Si te es posible, carga plásmidos no digeridos, linealizados e iradiados con luz UV uno cerca del otro en el gel de agarosa, luego puedes comparar las bandas entre las muestras.
  2. En general, las formas de monomero súperenrolladas CCC se mueven más rápido que cualquier otra forma, debido a que ellas tienen la estructura de ADN superenrollada y compacta. Además, aparacerán más abajo en el gel.
  3. Los monómeros circular abierto (CA) y lineal se mueven más lentamente que el monómero superenrollado CCC. Éstos tienen más dificultad para atravesar los poros de la matriz de gel que la forma CCC. Adicionalmente, la forma CA aparecerá más arriba en el gel. El orden de migración es usualmente la forma del monómero CCC (el más rápido), seguido por la forma lineal y luego la forma CA.
  4. El plásmido de ADN completamente digerido usualmente muestra sólo una única banda, una forma lineal del plásmido en su carril con el tamaño esperado. El plásmido no digerido puede tener dos formas de mostrar su carril: en forma de dímero CCC y en forma de monómero CCC. La forma de dímero, debido a su mayor y doble tamaño comparado a los monómeros, usualmente se mueve más lento que los monómeros. Adicionalmente, éste aparecerá más arriba en el gel que un monómero. La forma del monómero CCC corre más rápido que la forma lineal digerida del plásmido de ADN.



Ejemplos de formas de plásmidos en un electroforesis en gel. Carril 1: Marcador de peso molecular de ADN. Carril 2: Plásmido A no digerido. Carril 3: Plásmido A completamente digerido. Carril 4: Plásmido de ADN irradiado con luz UV.


Ejemplos de formas de plásmidos en un electroforesis en gel. Carril 1: Marcador de peso molecular de ADN. Carril 2: Plásmido A no digerido. Carril 3: Plásmido A completamente digerido. Carril 4: Plásmido de ADN irradiado con luz UV.

Ahora, como práctica, ¿puedes adivinar a que forma de plásmido corresponden las bandas en el gel de agarosa presentado en la siguiente figura?



Electroforesis en gel. Carril 1: Marcador molecular de ADN. Carril 2: Plásmido A no digerido. Carril 3: Plásmido A completamente digerido.

Respuesta:

En el carril 2, puedes visualizar dos bandas. La banda tenue en la parte superior es una forma CA y la de abajo es la forma CCC. Para el carril 3, es el plásmido completamente digerido, así la banda tiene una forma lineal.



¿Cómo Identificas Las Bandas En Un Gel De Agarosa?

Durante la electroforesis en gel, puedes cargar un plásmido de ADN no cortado, un fragmento de ADN digerido, un producto de PCR y probablemente un ADN genómico que uses como plantilla de PCR en los pozos. El fragmento de AND digerido es un producto de PCR digerido. El próximo paso es identificar en aquellas bandas cuál es el que se debe cortar.


Electroforesis en gel. Carril 1: Marcador de peso molecular de ADN. Carril 2: Plásmido A no digerido. Carril 3: Plásmido A completamente digerido. Carril 4: Producto de PCR digerido (o fragmento de ADN). Carril 5: Producto de PCR (con una tenue banda de dímero de primer o cebador). Carril 6: ADN genómico. Las flechas blancas indican las bandas que deseas cortar.


Tips para identificar la banda correcta a cortar de tu gel de agarosa

  1. El plásmido de ADN sin cortar en el gel de agarosa es fácil de identificar debido a que éste puede tener dos formas del plásmido (las formas CA y CCC).
  2. El plásmido digerido, el fragmento de ADN digerido, el producto de PCR y el ADN genómico pueden todos ser una sola banda. Para identificar estas bandas, deberás verificar el tamaño guiándote con el marcador de peso molecular de ADN. El plásmido digerido tiene una forma lineal con el tamaño entre las formas CA y CCC del plásmido no cortado. El ADN genómico tiene tamaño grande. Así, el ADN genómico usualmente se muestra en la parte más arriba del gel (muy cercano al pozo de carga).
  3. El fragmento de ADN digerido puede tener una única banda en un tamaño casi similar a un producto de PCR. Este es el tamaño seleccionado y la banda en este fragmento de ADN digerido es la que deseas extraer.
  4. Al final del carril del producto de PCR, podrás ver una banda tenue indicando pequeñas moléculas. Estas pequeñas moléculas son las moléculas del primer o cebador que unes a otra molécula cebador para formar un cebador dímero. El tamaño de estas pequeñas moléculas no son el tamaño que deseas seleccionar, así que no desearás extraer esta banda.





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Referencias

Cole, K. D., & Tellez, C. M. (2002). Separation of large circular DNA by electrophoresis in agarose gels. Biotechnology progress, 18(1), 82-87.

Green, M. R., & Sambrook, J. (2019a). Agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols, 2019(1), pdb. prot100404.

Johnson, P. H., & Grossman, L. I. (1977). Electrophoresis of DNA in agarose gels. Optimizing separations of conformational isomers of double-and single-stranded DNAs. Biochemistry, 16(19), 4217-4225.

Schleef, M. (2008). Plasmids for therapy and vaccination: John Wiley & Sons.

Schmidt, T., Friehs, K., & Flaschel, E. (2001). Structures of plasmid DNA. Plasmids for therapy and vaccination, 29-43




Escrito por: Tyas Kroemer

Traducido por: Adriana Gallego