La investigación genética se ha disparado en las últimas décadas con tecnologías emergentes, avances en la secuenciación y el avance de la sofisticación de la PCR. Esta breve descripción general examina algunas aplicaciones o áreas de la investigación genética y cómo se utiliza la PCR en este tipo de investigación.
A medida que el campo de la investigación genética se ha diversificado, también lo ha hecho la PCR. Ahora se han desarrollado y empleado variaciones personalizadas de la PCR para validar la investigación y para que sea una herramienta principal en la búsqueda o el análisis ascendente y descendente.
PCR Para Genotipado
Qué es la genotipificación: la genotipificación utiliza información de secuenciación para determinar diferencias o variantes genéticas en individuos o en poblaciones biológicas. Este tipo de técnica se utiliza para investigar una región predeterminada y muy específica del genoma. Por ejemplo, cuando se piensa en el ADN humano, un alto porcentaje es idéntico de un individuo a otro (más del 99%), pero aún existe una variación de una persona a otra, lo que nos hace muy únicos. La genotipificación se puede utilizar para analizar algunas de esas diferencias.
A veces hay dudas sobre cuál es la diferencia entre genotipificación y secuenciación. La secuenciación examina la información genómica de principio a fin, mientras que la genotipificación examina un aspecto muy específico del genoma y lo compara con datos de secuenciación conocidos. Esta comparación permite a los investigadores examinar las diferencias en la composición genética de un individuo o población. A menudo, se usa una analogía de libro para describir la diferencia entre genotipificación y secuenciación donde todo el libro sería tu genoma y secuenciar ese libro sería como leer todas las letras dentro del libro. Si hubiera un error de impresión en algunos de los libros, donde faltaba una sola letra en una página específica, el genotipado sería la herramienta para examinar ese tipo de situación.
Cómo se usa la PCR para la genotipificación: comprender la composición genética permite a los investigadores obtener más información sobre los rasgos fenotípicos. La PCR cuantitativa (qPCR) es solo un tipo de técnica utilizada para la genotipificación y se utiliza para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (o en inglés Single Nucleotide Polymorphism -SNP). Los beneficios de usar qPCR es la capacidad de obtener resultados de manera rápida y precisa, y minimiza el uso de otros materiales peligrosos.
La PCR para la genotipificación suele implicar el diseño de cebadores específicos para la mutación o el alelo que se está estudiando.
Tipos de PCR usados en genotipificación:
- PCR
- qPCR
- PCR seguida de Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (en inglés PCR-RFLP)
PCR Para Análisis de Microarreglos
Qué es el análisis de microarreglos: el análisis de microarreglos analiza qué genes se activan durante ciertos momentos con o sin tratamiento (condiciones experimentales), y puede evaluar simultáneamente miles de muestras.
Por ejemplo, ciertos genes se activan de noche, lo que conduce a la expresión de proteínas específicas de ese período de tiempo. Durante el día, esos genes nocturnos se desactivan y otro conjunto de genes puede activarse, generando otros tipos de proteínas necesarias durante el día.
El análisis de microarreglos es una forma en que los investigadores pueden comprender qué genes se activan o desactivan, y cuándo lo hacen.
En el análisis de microarreglos, una muestra de tejido puede compararse con una muestra control para determinar las diferencias en el nivel de expresión entre las dos. Durante el análisis de microarreglos, un tinte fluorescente se une a pequeños fragmentos de ADNc (ADN complementario) generado previamente a partir de las muestras experimentales y de control. El tinte rojo se utiliza para marcar el ADNc experimental y el tinte verde se utiliza para marcar el ADNc de la muestra control. El proceso se lleva a cabo en un chip que tiene miles de fragmentos de ADN complementarios tanto para la muestra experimental como para la muestra control. La mezcla de fragmentos de ADNc de la muestra experimental y control marcados fluorescentemente se aplica al chip para luego ser hibridados con su hebra complementaria.
Los resultados están codificados por colores verde, rojo o amarillo. El verde representaría niveles de expresión altos en la muestra control, el rojo representaría niveles altos en la muestra experimental y el amarillo representaría niveles de expresión iguales.
¿Cómo se utiliza la PCR en los microarreglos? La PCR puede desempeñar diferentes funciones con respecto al análisis de microarreglos. La RT-PCR se usa a veces antes de los microarreglos para amplificar el ADNc para su análisis. La PCR cuantitativa (qPCR) es un paso de validación importante para los microarreglos, que permite a los investigadores estar seguros de los resultados de la expresión génica. Mientras que el microarreglo analiza los niveles de expresión relativos de una muestra a su muestra de referencia comparativa, qPCR proporciona niveles de expresión cuantitativos.
A veces se elige un método en lugar de otro - una qPCR vs una situación de microarreglos. Si se trata de elegir entre métodos, los investigadores deberían elegir qPCR al evaluar la expresión génica en muestras conocidas. El microarreglo, por otro lado, es adecuado para situaciones en las que se está estudiando un mayor número de genes o para el análisis del transcriptoma completo entre dos muestras. Además, el microarreglo debe realizarse sólo cuando se dispone de una buena secuencia de referencia.
La conclusión es que qPCR y microarray pueden ir de la mano, usarse uno en lugar del otro o usarse para validación. En última instancia, la relación entre estas dos técnicas dependerá de los objetivos experimentales.
Tipos de PCR usadas en microarreglos:
- qPCR
- RT-qPCR <
- TaqMan qPCR
PCR Para Secuenciamiento de ARN (RNA-seq)
Qué es la secuenciación de ARN (RNA-seq): RNA-seq es un método de creación de perfiles que se utiliza para determinar los tipos de genes que están activados y en qué nivel se expresan. El proceso utiliza tecnología de secuenciación de próxima generación (en inglés Next Generation Sequencing -NGS) para analizar los niveles y la cantidad de expresión.
RNAseq permite a los investigadores estudiar la composición del ARN total dentro de una célula (transcriptoma) y conectar la información genómica con la funcionalidad de la proteína. Al igual que los microarreglos, el RNA-seq nos da una idea de qué genes se activan durante períodos específicos o bajo ciertas condiciones, lo que nos permite comparar la producción de proteínas en diferentes condiciones experimentales. Utilizando la tecnología NGS, los investigadores ahora pueden realizar una secuenciación de ARN precisa a niveles de alto rendimiento.
Cómo se usa la PCR en RNA-seq: La PCR se puede usar en la producción de bibliotecas de secuencia de ARN (que produce ADNc a partir de ARNm), así como en la amplificación de muestras para la secuenciación. La primera parte del proceso implica la transcripción inversa para obtener ADNc. A esto le sigue la amplificación mediante PCR.
La PCR en emulsión (ePCR) es otra variación de la PCR que se usa típicamente para la amplificación antes de la NGS. Este tipo de PCR utiliza superficies de perlas, agua y aceite. La PCR en emulsión permite la amplificación simultánea de cada secuencia sin riesgo de contaminación. Aquí, cada perla actúa como un microreactor para la PCR, y cada una contiene una hebra de ADN.
La PCR puente es otro método utilizado para amplificar secuencias antes de NGS. Aquí, dos tipos de oligos se fijan a una celda de flujo. Cada oligo es complementario de cada adaptador que flanquea el fragmento de ADN. Los adaptadores flanqueantes permiten que se forme un puente entre los dos tipos de oligos. Después de desnaturalizar cada copia, las hebras individuales se unen a los oligos y el proceso se repite.
Tipos de PCR usadas en RNA-seq:
- RT-PCR
- RT-qPCR
- PCR en emulsion (ePCR)
- PCR puente
PCR Para Polimorfismos de Nucleótido Único (SNPs)
¿Qué son los polimorfismos de nucleótido único (SNP)? Los polimorfismos de nucleótido único (SNP) son sustituciones de un solo nucleótido dentro de una determinada región de un genoma que ocurren en más del 1% de una población determinada. El genoma humano es aproximadamente un 99,5% idéntico de un individuo a otro. De esa variación del 0,5%, los SNPs contribuyen con aproximadamente el 90%. Estas variaciones son las que hacen que los organismos sean únicos. En los seres humanos, los SNP (cortes pronunciados) son el tipo más común de variación genética y ocurren con una frecuencia de aproximadamente uno de cada 100-300 nucleótidos. Por lo general, son el resultado de un error de copia o reparación, pero también pueden ser el resultado de enfermedades que causan mutaciones.
Si bien los SNP ocurren con bastante frecuencia en el genoma humano, es poco probable que tengan un impacto en la función celular a menos que la sustitución se produzca en una región codificante de proteínas del genoma. Aún así, los SNP que se encuentran en regiones no codificantes pueden generar factores de riesgo de enfermedades y cáncer. Los SNP no solo están asociados con fenotipos de enfermedades, sino que también pueden estar asociados con diferentes características en los organismos. SNPedia es una base de datos de tipo wiki dedicada al estudio de la variación en la genética humana. Entre algunos de los SNP que se han investigado más popularmente se encuentran las variaciones que causan las características de la cera de oídos, los factores de riesgo del cáncer de mama y la diabetes tipo 2, las influencias del receptor de oxitocina y más.
El estudio de los SNP les brinda a los investigadores información sobre las enfermedades, no solo su causa; los SNP también ayudan a los investigadores a identificar regiones relevantes para enfermedades específicas.
Cómo se usa la PCR para analizar SNP: Recuerde que el genotipado es el proceso de comparar la información de la secuencia de ADN para identificar diferencias en individuos y poblaciones. La PCR cuantitativa (qPCR) se usa generalmente para genotipar SNP con el fin de amplificar e identificar SNP. La PCR cuantitativa será ideal en situaciones en las que se están estudiando pocos SNP. Es adecuado para una cantidad grande y pequeña de muestras y permite un análisis rápido y preciso.
El Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR (ARMS PCR) es otro tipo de técnica de PCR utilizada para genotipar los SNP. Aquí, los cebadores específicos de secuencia tanto para el alelo normal como para el que contiene SNP (mutante) se utilizan en una única reacción de PCR. Los cebadores amplificarán el alelo normal o el alelo mutante, que se pueden visualizar al analizar los fragmentos amplificados con electroforesis en gel de agarosa.
Otras técnicas de genotipado de SNP incluyen secuenciación y análisis de microarreglos.
Tipos de PCR:
- qPCR
- ARMS PCR
- qPCR
- RT-PCR
- RT-qPCR
PCR Para Análisis de Alelos y Análisis de Expresión Génetica
Qué es el análisis de expresión específica de alelo: El análisis de expresión específica de alelo (ASE) es una herramienta que se utiliza para evaluar la diferencia en la expresión alélica entre ambos alelos parentales. El nivel de expresión alélica dentro de los diploides diferirá entre los dos alelos parentales heredados, expresándose uno preferentemente sobre el otro. La regulación de la expresión alélica, que se expresa de manera desigual, se denomina expresión específica de alelo (o desequilibrio alélico).
Se cree que estas diferencias de expresión se pueden atribuir en parte al elemento regulador cis, un área de ADN no codificante que regula la transcripción de genes cercanos en la misma hebra de ADN. Los ejemplos de elementos reguladores cis incluyen regiones reguladoras, promotores de genes, el terminador, el sitio de unión ribosomal del ARN y el potenciador.
El estudio de la expresión alélica proporciona más información sobre la variación fenotípica del organismo y las enfermedades dentro de las poblaciones.
¿Qué es el análisis de expresión génica? El análisis de expresión génica evalúa la regulación génica y los productos génicos utilizando ARN para determinar patrones de expresión génica. La investigación de la expresión genética es importante para comprender la funcionalidad celular a través de productos proteicos, comprender la actividad general, comprender el flujo y la regulación de la información del ADN al ARN, y comprender cómo la cantidad de proteínas producidas impacta en un sistema, etc.
¿Cómo se usa la PCR para la expresión específica de alelos y el análisis de la expresión génica? La secuenciación de ARN (RNA-seq) es una forma común de estudiar la expresión de genes y alelos. El RNA-seq puede mostrar cuantitativamente diferencias en los niveles de expresión entre muestras comparadas. Sin embargo, la PCR es otro método que utilizan los investigadores para estudiar la expresión.
La PCR cuantitativa (qPCR) y la PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) son los tipos de PCR que se utilizan principalmente en la investigación de la expresión génica. Uno de los beneficios de RT-qPCR es que es adecuado para una cuantificación de ARN más sensible. También suele ser una mejor opción cuando se analizan sólo unos pocos genes con una secuencia conocida.
Tipos de PCR usados para estudiar la expresión específica de alelo y la expresión génica:
- qPCR
- RT-PCR
- RT-qPCR
PCR Para Análisis de Metilación de ADN
¿Qué es la metilación y el análisis de metilación del ADN? El proceso en el que se agrega un grupo metilo (CH3) al ADN se denomina metilación del ADN. La metilación ayuda a regular la expresión génica al reprimir la transcripción. Esta actividad cambia la función genética sin alterar las secuencias de ADN y es uno de los muchos mecanismos epigenéticos.
Los procesos de expresión génica atribuidos a la metilación del ADN incluyen impresión genómica, inactivación, desarrollo y envejecimiento del cromosoma X.
El análisis de la metilación del ADN implica un amplio conjunto de métodos utilizados para abordar las preguntas planteadas durante la investigación. La elección de un método de análisis dependerá de varios factores, incluyendo los objetivos, la calidad de la muestra, la sensibilidad requerida, el presupuesto, etc.
Sergey Kurdyukov y Martyn Bullock publicaron "Análisis de Metilación de ADN: Escogiendo el Método Adecuado" en 2016 con una guía detallada sobre cómo elegir una aproximación para el análisis.
- Métodos basados en si los candidatos son conocidos o desconocidos:
- Opciones cuando se conocen genes candidatos:
- Conversión de bisulfito seguida de PCR específica de metilación, COLD-PCR, secuenciación, pirosecuenciación o matriz de perlas.
- Realice PCR o qPCR después de la digestión.
- Opciones cuando se desconocen los genes candidatos:
- Perfil de metilación del genoma completo seguido de ELISA, espectrometría de masas, HPLC-UV, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) o PCR de LINE-1 seguido de pirosecuenciación.
- Busque regiones metiladas diferencialmente seguidas de recuento de cortes sensibles a metilo (MSCC), microarreglos o matriz de perlas, o secuenciación de bisulfito.
Cómo se usa la PCR para analizar la metilación del ADN: existen varios tipos de técnicas de PCR para amplificar y estudiar mucho mejor la metilación. Los diferentes tipos de PCR abordan ciertos obstáculos o necesidades de investigación.
Por lo general, la PCR comienza primero con la conversión de bisulfito porque los métodos de secuenciación posteriores no pueden distinguir entre citosina metilada y citosina no metilada. El bisulfito desamina la citosina en un uracilo. Después de la conversión, el ADN puede amplificarse mediante PCR, lo que permite una mayor clonación y secuenciación para comprender mejor la metilación.
La parte complicada de la conversión de bisulfito es que el ADN comenzó con 4 nucleótidos (A, T, C, G) y ahora solo tiene 3 (A, T, G). Esta pérdida de complejidad del ADN también crea desafíos para el diseño de cebadores.
La PCR anidada es una forma de reducir estos desafíos. Los investigadores también han empleado otros tipos de técnicas de PCR para superar obstáculos o satisfacer las necesidades de su investigación. A continuación, en la sección de tipos de PCR hay descripciones breves de cada tipo de PCR.
Tipos de PCR utilizados para el análisis de metilación de ADN:
- qPCR - qPCR también se denomina PCR cuantitativa o en tiempo real. Esta técnica de PCR monitorea la cantidad de amplificación del producto de PCR en tiempo real.
- PCR anidada: la PCR anidada se utiliza para minimizar la unión inespecífica mediante el uso de dos ciclos secuenciales de PCR, el segundo ciclo amplifica un objetivo secundario del primer ciclo.
- PCR específica de metilación: la PCR específica de metilación utiliza cebadores específicos de metilación y amplifica el ADN en función de si la muestra de ADN fue metilada o no.
- PCR de fusión de alta resolución: el análisis de fusión de alta resolución (HRM) sigue a la PCR y es una forma de determinar las curvas de fusión de los fragmentos de ADN.
COLD-PCR (co-amplificación a una temperatura de desnaturalización más baja-PCR): COLD-PCR permite a los investigadores amplificar preferentemente los alelos minoritarios en presencia de alelos de tipo salvaje.
Referencias
(2014). Retrieved July 12, 2019, from https://www.nature.com/scitable/topicpage/gene-expression-14121669
23 and Me. (2019). What is the difference between genotyping and sequencing? Retrieved July 12, 2019, from https://customercare.23andme.com/hc/en-us/articles/202904600-What-is-the-difference-between-genotyping-and-sequencing-
23andMe. (n.d.). What are SNPs? Retrieved July 12, 2019, from https://www.23andme.com/gen101/snps/
Ababon, M. (2016, July 09). Get that Genotyping PCR to Work EVERY TIME. Retrieved July 12, 2019, from https://bitesizebio.com/28738/get-genotyping-pcr-work-every-time/
Ap Tech Nova. (2018, April 25). DNA Microarray Technology. Retrieved July 12, 2019, from https://www.youtube.com/watch?v=yzBVOCwRanI
AuLab. (2016, October 22). Retrieved July 12, 2019, from https://www.youtube.com/watch?v=PZW_eyDzYVQ
Bioinformatics, U. (2014, August 13). Bridge Amplification Part 1. Retrieved from https://www.youtube.com/watch?v=3URxJD5k3T8
Blog, R. (2018, April 20). A Workflow Guide to RNA-seq Analysis of Chaperone Function and Beyond. Retrieved July 12, 2019, from https://www.rna-seqblog.com/a-workflow-guide-to-rna-seq-analysis-of-chaperone-function-and-beyond/
Bridge PCR. (n.d.). Retrieved July 12, 2019, from https://binf.snipcademy.com/lessons/ngs-techniques/bridge-pcr
Castel, S. E., Levy-Moonshine, A., Mohammadi, P., Banks, E., & Lappalainen, T. (2015). Tools and best practices for data processing in allelic expression analysis. Genome Biology,16(1). doi:10.1186/s13059-015-0762-6
Dorak, T. (2007, June). Genotyping with PCR. Retrieved July 12, 2019, from https://www.the-scientist.com/lab-tools-old/genotyping-with-pcr-46437
Emulsion PCR ePCR. (n.d.). Retrieved July 12, 2019, from https://binf.snipcademy.com/lessons/ngs-techniques/emulsion-pcr
EncyclopediaBritannica. (2018, December 05). Single nucleotide polymorphism. Retrieved July 12, 2019, from https://www.britannica.com/science/single-nucleotide-polymorphism
FGRS: Protocol RNA-seq Library Preparation. (2011). Retrieved July 12, 2019, from http://fg.cns.utexas.edu/fg/protocol__RNA-seq_Library_Preparation.html
Gene Expression Analysis. (n.d.). Retrieved July, 2019, from https://www.rtsf.natsci.msu.edu/genomics/gene-expression-analysis/
Hadfield, J. (2017, December 07). An Introduction to RNA-seq. Retrieved July 12, 2019, from https://bitesizebio.com/13542/what-everyone-should-know-about-rna-seq/
Hellemans, J. (2019, August 26). Benchmarking RNA sequencing sensitivity using transcriptome-wide RT-qPCR data. Retrieved July 12, 2019, from https://blog.qbaseplus.com/benchmarking-rna-sequencing-sensitivity-using-transcriptome-wide-rt-qpcr-data
Khan, R. (2019). What is genotyping? Retrieved July 12, 2019, from https://help.insito.me/en/articles/859665-what-is-genotyping
Kurdyukov, S., & Bullock, M. (2016, January 06). DNA Methylation Analysis: Choosing the Right Method. Retrieved July 12, 2019, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4810160/
Learn Genetics. (n.d.). DNA Microarray. Retrieved July 12, 2019, from https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/
Little, S. (2001, May 01). Amplification‐Refractory Mutation System (ARMS) Analysis of Point Mutations - Little - 1995 - Current Protocols in Human Genetics - Wiley Online Library. Retrieved July 19, 2019, from https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/0471142905.hg0908s07
Lutze, K. (2017). 7 Secret Tricks to Optimize Emulsion PCR in the NGS Workflow. Retrieved July 12, 2019, from https://blog.hseag.com/7-secret-tricks-to-optimize-emulsion-pcr-in-the-ngs-workflow
Mackenzie, R. (2018). RNA-seq: Basics, Applications and Protocol. Retrieved July 12, 2019, from https://www.technologynetworks.com/genomics/articles/rna-seq-basics-applications-and-protocol-299461
Morey, J. S., Ryan, J. C., & Van Dolah, F. M. (2006). Microarray validation: Factors influencing correlation between oligonucleotide microarrays and real-time PCR. Retrieved July 12, 2019, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779618/
NIH. (2019). What are single nucleotide polymorphisms (SNPs)? - Genetics Home Reference - NIH. Retrieved July 12, 2019, from https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/snp
NIH. (2015, August 27). DNA Microarray Technology Fact Sheet. Retrieved July, 2019, from https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Microarray-Technology
Shepherd, C. (2019, June 20). Quantifying Allele-Specific Gene Expression Using PCR-Based Methods. Retrieved July 12, 2019, from https://bitesizebio.com/36768/quantifying-allelle-specific-gene-expression-using-pcr-based-methods/
StatQuest with Josh Starmer. (2017, August 31). Retrieved July 12, 2019, from https://www.youtube.com/watch?v=tlf6wYJrwKY&t=636s
Udacity. (2015, February 23). Retrieved July 12, 2019, from https://www.youtube.com/watch?v=qS8eboruKFE
USD Bioinformatics. (2014, August 15). Emulsion PCR. Retrieved July 12, 2019, from
Wang, Z., Gerstein, M., & Snyder, M. (2009, January). RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Retrieved July 12, 2019, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2949280/
Zou, J. (n.d.). ASE. Retrieved July 12, 2019, from http://genetics.cs.ucla.edu/ase/
Escrito por: Katharine Martin
Traducido por: Adriana Gallego, Ph.D.
