La transformación bacteriana es un procedimiento rutinario en laboratorios de biología molecular. Después de la transformación, solo deberás proceder con la reacción de ligación en células competentes de Escherichia coli y el plateo de las células, y luego esperar hasta que en tu caja Petri crezca un número decente de colonias al día siguiente.

Pero con frecuencia lo anterior no es el resultado esperado y puedes encontrar algunos problemas en tu caja Petri, tales como la ausencia de colonias, la presencia de colonias satélites o un sobrecrecimiento de colonias. Este artículo te provee con algunos factores que afectan la transformación bacteriana exitosa, además de una guía rápida de resolución de problemas con el fin abordar las dificultades que se presenten después de la transformación.

¿Cuáles Son Los Factores Que Afectan La Transformación Bacteriana Exitosa?

1.Eficiciencia de Transformación de Células Competentes

Las células competentes con baja eficiencia de transformación causan que pocas o ninguna colonia crezcan en la caja Petri. Para calcular la eficiciencia de transformación, debes usar un plásmido a una concentración conocida, como por ejemplo pUC19, para transformar tus células competentes.

Cómo calcular la eficiencia de transformación

La eficiencia de transformación (ET) es el número de unidades formadoras de colonias producidas por transformar 1 µg de plásmido de ADN en un volumen conocido de células competentes.

Por ejemplo, puedes transformar 1 µl de (10 pg/µl) del plásmido pUC19 en 25 µl de nuestras Células químicamente competentes DH10B de GoldBio.

Luego mezclas las células competentes con 975 µl de Medio de Recuperación en un tubo de ensayo. Luego diluyes 10 µl del anterior volumen en 990 µl de Medio de Recuperación y posteriormente emplatas 50 µl del medio diluído.

Al siguiente día, puedes contar 250 colonias en tu caja Petri.

Basado en esta información, calculas:

  • Colonias = 250
  • µg of DNA = 0.00001 (or 10 pg = 0.00001 ug)
  • Dilución = 10/1000 x 50/1000 = 0.0005

Además, la eficiencia de transformación de tus células competentes las calculas así:

ET = 250/0.00001/0.0005 = 5.0 × 1010

Para un plásmido pequeño, como por ejemplo pUC19, 5.0 × 1010 cfu/μg es una ET relativamente alta. Adicionalmente, estas células competentes son altamente eficientes.

Para aprender más acerca de cómo calcular la eficiencia de transformación de tus células competentes, te invito a mirar el siguiente video de GoldBio:

https://www.youtube.com/watch?v=cmpMfhAA2Mw


2. Plásmido

El plásmido usado en transformación puede afectar la eficiencia de transformación. Por ejemplo, la eficiencia de transformación usando un plásmido grande es típicamente más baja que la de un plásmido pequeño. Para transformar un plásmido grande, la selección de las células competentes adecuadas y el método de electroporación pueden ayudar a mejorar la eficiencia de transformación.

Otro factor a considerar, es chequear la concentración de ADN recomendada a usar en el protocolo. Basado en el protocolo de Células químicamente competentes DH10B de GoldBio, las cantidades recomendadas de ADN a usar en la transformación están entre 1 pg - 100 ng de ADN. Además, puedes usar 1 µl de reacción de ligación conteniendo al menos 1 pg de ADN para transformar estas células.


3. Medio de Crecimiento

La bacteria transformada sufre un proceso de tratamiento de calor o pulso eléctrico para crear poros temporales en su pared celular. De esa forma, las células pueden ingresar fácilmente el ADN. Posteriormente para recuperarse del estrés, las células necesitan crecer un medio rico en nutrientes como el medio SOC.

Para encontrar más acerca de este medio de cultivo especial, te invitamos a leer el siguiente artículo de GoldBio dando click en el siguiente link

Revisión rápida del Medio de Cultivo SOC y el Medio de Recuperación para Células Competentes


4.Temperatura

La temperatura juega un rol clave durante la transformación bacteriana, particularmente para transformar químicamente células competentes.

Por ejemplo, nuestras Células químicamente competentes DH10B GoldBio, requieren un tratamiento de choque de calor secuencial como se describe a continuación: incubación a 0°C durante 30 minutos, seguido por incubación a 42°C por 45 segundos, y luego se retorna a 0°C por 2 minutos. Cualquier paso incorrecto en este proceso puede afectar el resultado de la transformación.

Directamente después de la transformación, las células transformadas necesitan una temperatura cálida de 37°C para crecer óptimamente. Un método para hacer esto es usando una incubadora con agitación. Este tipo de incubadoras tambien distribuyen los nutrientes uniformemente a todas las células en el medio de crecimiento.


5. Selección de Antibiótico

El antibiótico presente en tu caja Petri afecta el número de colonias que crecerán en la caja despúes de la transformación. Usar el antibiótico incorrecto provoca que no crezcan colonias en la caja Petri. Mientras que usar la concentración del antibiótico muy baja, resulta en lo que se conoce como un ¨césped bacteriano¨. Un césped bacteriano es la aparición de colonias en la caja Petri pero formando una capa uniforme, es decir, no se difenrencian colonias individuales.

Para asegurarte de que estás usando el antibiótico correcto debes verificar el marcador de selección en tu plásmido. El marcador de selección es típicamente un gen de resistencia a antibiótico. Por ejemplo, si el plásmido contiene un gen de resistencia a ampicilina, debes usar ampicilina en tu caja Petri para eliminar las células no transformadas. Adicionalmente, sólo las células transformadas crecerán en la caja Petri.

Independiente del antibiótico que uses, ten en cuenta que incubar la caja por mas de 16 horas puede causar el crecimiento de colonias satélites.

Para resolver problemas de colonias satélites, busca nuestro artículo GoldBio en el siguiente enlace:

Resolución de problemas: Colonias satélites



Guía De Resolución De Problemas Con Transformación Bacteriana

1. Evalua la Eficiencia de Transformación de las Células Competentes

Incluye una caja Petri control en tu experimento y calcula la eficiencia de transformación. Puedes usar nuestro calculador de eficiencia de transformación para calcular este número. Para favorecer la eficiencia de transformación puedes usar células competentes disponibles comercialmente, tales como nuestras Células Competentes GoldBio.


2.Verifica el Protocolo de Transformación

Equivocarse en un paso durante el proceso de transformación puede afectar su éxito. Por tanto, debes verificar que llevaste a cabo todos los pasos correctamente.


3. Verifica los Antibióticos

Asegúrate de usar el antibiótico correcto con la concentración recomendada para seleccionar las células transformadas. Además, antes de adicionarlo, asegúrate que el antibiótico no está muy viejo y que la temperatura del medio de cultivo no esté muy caliente.


4.Evalúa el Medio de Crecimiento

Usa un medio especial para cultivar células transformadas, como por ejemplo el medio SOC o nuestro Medio de Recuperación de Células Competentes GoldBio. Por último, evalúa el medio de cultivo dispersando y sembrando células de E. coli.


Productos Relacionados

Células competentes ofertadas por GoldBio

DH10B Chemically Competent E. coli Cells (Catalog No. CC-100)

DH5-alpha Chemically Competent E. coli Cells (Catalog No. CC-101)

BL21 Chemically Competent E. coli Cells (Catalog No. CC-102)

BL21 (DE3) Chemically Competent E. coli Cells (Catalog No. CC. 103)

DL39 (DE3) Chemically Competent E. coli Cells (Catalog No. CC-104)

DH10B Electrocompetent E. coli Cells (Catalog No. CC-200)

DH10B-Pro™ Electrocompetent E. coli Cells (Catalog No. CC-201)

DH5-alpha Electrocompetent E. coli Cells (Catalog No. CC-203)

BL21 (DE3) Electrocompetent E. coli Cells (Catalog No. CC-204)

Popular Antibiotics Products

Ampicillin (Sodium), USP Grade (Catalog No. A-301)

Ampicillin (Sodium) EZ Pak™ for 100 mg/mL Solution (Catalog No. A-301-EZ)


Referencias

‌Gooch, J. W. (2011). Bacterial Lawn. Encyclopedic Dictionary of Polymers, 877–877. https://doi.org/10.1007/978-1-4419-6247-8_13222.

Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology, 166(4), 557–580. https://doi.org/10.1016/s0022-2836(83)80284-8.

Medaney, F., Dimitriu, T., Ellis, R. J., & Raymond, B. (2016). Live to cheat another day: bacterial dormancy facilitates the social exploitation of β-lactamases. The ISME journal, 10(3), 778.

Ohse, M., Takahashi, K., Kadowaki, Y., & Kusaoke, H. (1995). Effects of plasmid DNA sizes and several other factors on transformation of Bacillus subtilis ISW1214 with plasmid DNA by electroporation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 59(8), 1433–1437. https://doi.org/10.1271/bbb.59.1433.

Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., & Mobasheri, H. (2016). Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications, 5(4), 257–261. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC53264...

Rolinson, G., Macdonald, A., & Wilson, D. (1977). Bactericidal action of β-lactam antibiotics on Escherichia coli with particular reference to ampicillin and amoxycillin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 3(6), 541-553.

Yurtsev, E. A., Chao, H. X., Datta, M. S., Artemova, T., & Gore, J. (2013). Bacterial cheating drives the population dynamics of cooperative antibiotic resistance plasmids. Molecular Systems Biology, 9(1), 683. doi:10.1038/msb.2013.39

Tags

Antibiotics Tyasning Kroemer electroporation competent cells Plasmid DNA ampicilin Recovery Medium bacterial transformation chemically competent cells ligation reaction transformation efficiencies heat shock step antibiotic concentration antibiotic resistance gene colony forming units pUC19 transformation protocol temperature growth medium

Escrito por: Tyasning Kroemer, Ph.D.

Traducido por: Adriana Gallego, Ph.D.