La clonación molecular es una técnica básica en laboratorios de biología molecular y biotecnología. La clonación es útil para estudiar y modificar un gen o reintroducir un gen modificado procedente de un hospedero natural a otro o para producir una proteína. Puedes hacer clonación molecular al incorporar una pieza de ADN dentro de un plásmido (un ADN recombinante) para producir más del mismo ADN recombinante dentro de un organismo hospedero viviente. Algunas cosas que debes considerar antes de clonar son: la disponibilidad de de los materiales de clonación, el objetivo de la investigación (por ejemplo secuenciar un fragmento de ADN o producir una proteína), y el nivel de dificultad para llevar a cabo el protocolo.


Materiales para clonación

Para empezar un proceso de clonación, debes preparar algunos materiales importantes que se listan a continuación:

Fragmento de ADN

El recurso para el fragmento de ADN o ¨inserto de ADN¨ puede ser ADN genómico, ADN complementario, plásmido de ADN, producto de PCR, o ADN sintético. El inserto de ADN debe contener secuencias particulares al final de los fragmentos que sean compatibles con el vector preparado. Puedes añadir estas secuencias particulares dentro de la secuencia del inserto de ADN utilizando la técnica de PCR.


El vector

Un vector es una molécula de ADN la cual lleva un inserto de ADN para generar una ADN recombinante y replicarse dentro de un hospedero particular.

Algunos ejemplos de vectores son:

  • Cósmidos: Es un vector de ADN largo que contiene una secuencia de ADN del fago λ. Este puede llevar un gran fragmento de ADN de hasta 45 kilobases al hospedero.
  • Cromosoma artificial: Es un vector de ADN largo el cual puede llevar a cabo las funciones de un cromosoma.
  • Plásmido: Es un pequeño ADN circular extracromosómico el cual puede replicarse en una célula y es comúnmente usado en clonación.

Plasmid con origen de replicacion y mercador de seleccion

Ejemplo de un mapa de plásmido.

Elementos en un vector de plásmido:

  • Origen de Replicación (ORI): Es una secuencia o elemento que se requiere para la replicación del plásmido al interior del hospedero.
  • Marcador de selección: Es un elemento requerido para clonación con el fin de seleccionar al hospedero que lleva el constructo de ADN. Sólo las células hospederas que crecen en el medio de cultivo conteniendo un agente de selección particular tendrán el constructo de ADN con un marcador de selección dentro de la célula. Por ejemplo, los marcadores de selección en el constructo de ADN con frecuencia contienen genes de resistencia a antibióticos. Un hospedero transformado tiene el gen antibiótico en el constructo de ADN, que además le permite crecer en el medio de cultivo conteniendo ese antibiótico en particular. Por otro lado, la célula hospedera que no contenga el constructo de ADN no podrá sobrevivir en el medio selectivo.



seleccion bacteriana



  • Sitio de Clonación Múltiple (SCM): Es un elemento presente en el plásmido el cual contiene sitios de enzimas de restricción que permiten la inserción de ADN. Las enzimas de restricción compatibles cortan en los SCM del plásmido y el inserto de ADN durante el proceso de clonación.
  • Región promotora: Es una región la cual dirige la expresión de proteínas del ADN clonado.
  • Etiqueta de proteína: Es una secuencia particular que produce una proteína con una función específica, y es usualmente anexada a una proteína recombinante. Un ejemplo de una etiqueta de proteína es la luciferasa o la proteína verde fluorescente (en inglés GFP), las cuales permiten monitorear o cuantificar la proteína recombinante.
  • Señal de poliadenilación: Es un elemento conteniendo una cola poli-A que es importante para producir una proteína.




Células competentes

Después de que el fragmento de ADN es incorporado en el plásmido vector, el siguiente paso es llevar a cabo la transformación. En este paso, el ADN recombinante es introducido al interior de una célula competente por medio de una reacción química o electroporación. Las células competentes son células temporalmente permeables al ADN extracelular. Los organismos hospederos que funcionan como células competentes comúnmente usados en los laboratorios son Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae.


Medio selectivo

El medio selectivo es un medio de crecimiento conteniendo un agente selectivo donde crece el hospedero transformado. Cuando escoges un antibiótico de selección para hacer clonación, el medio de cultivo debe contener estos antibióticos. Los antibióticos comúnmente usados para selección son Ampicilina, Kanamicina y Cloranfenicol.


MÉTODOS DE CLONACIÓN

Existen varias aproximaciones para clonar y necesitarás encontrar la forma correcta y adecuada para tu investigación. Abajo encontrarás algunos ejemplos de métodos de clonación populares para generar un constructo de ADN recombinante.


Clonación basada en enzimas de restricción

Las enzimas de restricción son enzimas que cortan el ADN cerca a una secuencia nucleotídica corta específica en un punto conocido como sitio de restricción. El método de clonación basado en enzimas de restricción depende de la actividad de las enzimas de restricción para ¨cortar¨ tanto el vector como el inserto de ADN como de la habilidad de la ADN ligasa para ¨pegar¨ el fragmento de ADN dentro del vector. Este método es útil cuando se tiene un inserto de ADN a incorporar dentro de un plásmido.

Usando PCR, puedes adicionar sitios para enzimas de restricción en el inserto de ADN. Tu inserto de ADN no debe contener un sitio de restricción interno similar al sitio de restricción en el plásmido ya que la enzima de restricción puede cortar tu inserto de ADN en este sitio de restricción interno y producir pequeñas piezas indeseables de fragmentos de ADN.

Puedes escoger usar una o dos enzimas de restricción para cortar el fragmento de ADN y el vector. Cuando uses dos enzimas de restricción, ambas enzimas deben ser compatibles o trabajar bien en el mismo buffer de enzimas de restricción.


PCR, digestion con enzima de restriccion, ligacion, y transformacion


Clonación basada en enzimas de restricción. 1. Secuencias cortas conteniendo sitios de restricción son adicionadas al extremo 5’ de los primers para amplificación de ADN por PCR. 2. Tanto el vector como el fragmento de ADN son digeridos por enzimas de restricción para crear extremos cohesivos. 3. El vector y el fragmento de ADN son ligados. 4. El ADN recombinante ingresa a la célula hospedera durante la transformación.



Clonación por PCR

La clonación por PCR se basa en un proceso llamado ligación, el cual es un método para insertar un fragmento de ADN dentro de un vector usando una ADN ligasa. La razón por la cual la ligación es importante en este paso es porque es responsable de insertar el producto de PCR dentro un un plásmido con una ¨cola T¨.

A través de PCR se amplifican insertos que contienen un residuo de adenina en el extremo 3’ de los fragmentos de ADN (extremos de ‘cola A’). Un plásmido vector con una ¨cola T¨ contiene un único 3’ deoxitimidina (T) en cada extremo de los brazos del plásmido lineal. Por tanto, estos productos de PCR pueden ser ligados dentro de vectores con ¨cola T¨ usando una ADN ligasa, luego este paso es seguido por transformación.

Puedes escoger este método cuando las enzimas de restricción no son compatibles o existe un sitio de restricción interno en su inserto de ADN.

Una desventaja de este método es que necesitará un vector específico con ¨cola T¨ para llevar a cabo el proceso de clonación. Sin embargo, los vectores con ¨cola T¨ pueden no tener elementos de soporte para tu proteína de interés, como por ejemplo la una región promotora o una etiqueta de proteína.




pcr y ligacion

Clonación por PCR. 1. Un producto de PCR con una ¨cola A¨ es combinado con un vector con una ¨cola T¨. 2. Durante la ligación, el producto de PCR es insertado en el vector.


Ligación Independiente de Clonación (LIC)

La ligación independiente de clonación (LIC) es llevada a cabo generando secuencias cortas en el extremo del inserto de ADN que se alinean a secuencias cortas en el plásmido vector. Las enzimas con actividad 3’ a 5’ exonucleasa eliminan los extremos 3’ y generan extremos cohesivos entre el fragmento de ADN y el vector lineal. Los dos materiales son luego combinados para el paso de alineación. Durante la transformación, el organismo hospedero repara las secciones rotas salientes formadas en el ADN recombinante.

La ventaja de este método es que no creará ningún sitio de restricción o secuencias indeseables en el constructo de ADN final.



Clonación LIC. 1.Las secuencias cortas que alinean con secuencias en el plásmido son adicionadas en los extremos 5’ de los primers para la amplificación de ADN por PCR. 2. El plásmido se vuelve lineal usando enzimas de restricción. 3. Tanto el inserto de ADN como el vector son tratados con 3’ a 5’ exonucleasa para crear extremos cohesivos. 4. Ambos, el ADN y el vector son alineados. 5. Después de la transformación, las células hospederas reparan las secciones rotas salientes en el ADN recombinante.


Clonación Lisa (CL)

La técnica de clonación lisa o sin costuras (CL) (similar a LIC) se basa en alinear secuencias cortas del extremo del fragmento de ADN a secuencias cortas en el plásmido vector. El método CL requiere una enzima con actividad 5’ a 3’ exonucleasa para crear proyecciones 3’, una ADN polimerasa para llenar los vacíos, y una ADN ligasa para unir los fragmentos rotos de las salientes de ADN.

La ventaja de LIC y CL sobre el método de clonación basado en enzimas de restricción es que permite la inserción de más de un fragmento de ADN dentro del vector. Además, cuando existen sitios para enzimas de restricción internos en su fragmento de ADN, puedes usar LIC o CL como método de clonación opcional.

clonacion lisa (CL)

Clonación lisa. 1. Secuencias cortas son adicionadas a los extremos 5’ de los primers para amplificación de ADN por PCR. 2. El vector es digerido por una enzima de restricción 3. Tanto el fragmento de ADN como el vector son tratados con una enzima con actividad 5’ a 3’ exonucleasa para crear extremos salientes cohesivos. 4. Durante la ligación, el fragmento de ADN se inserta en el vector.



Clonación por recombinación

Este método requiere enzimas recombinasas de ADN sitio-específicas, las cuales intercambian y recombinan piezas de ADN con sitios de recombinación particulares.

El primer paso en este método es insertar un fragmento de ADN dentro de un vector de entrada para generar un clon de entrada. Otra forma para crear un clon de entrada es intercambiando y recombinando un vector donante en un clon de entrada.

Después de crear el clon de entrada, el próximo paso es intercambiar y recombinar el clon de entrada con el clon de destino. El beneficio de esta aproximación es que puede ser usada para ubicar más de cinco elementos en un único vector. Esto es comúnmente usado para identificar interacción de unión a proteínas o para optimizar la expresión de proteínas, purificarlas o solubilizarlas. Para llevar a cabo este método, necesitarás un plásmido particular el cual tiene sitios de recombinación.

Clonación por recombinación y transformacion

Clonación por recombinación. 1. El fragmento de ADN es insertado dentro de un vector de entrada para clear un clon de entrada. 2. El clon de entrada y el vector de destino son combinados con una enzima recombinasa para crear el clon de destino.

En este artículo, brevemente explicamos los cinco métodos de clonación molecular que son comúnmente empleados por los investigadores. La clonación molecular ha sido empleada para diferentes propósitos en distintos campos de investigación. En agricultura, la clonación ha recortado el tiempo que se requiere para insertar y desarrollar una nueva variedad con características benéficas, tales como rasgos de tolerancia a sequía o pestes y enfermedades. Por otro lado, la clonación molecular ha sido usada para producir proteínas terapéuticas tales como proteínas de disolución de coágulos e interferón, o para sintetizar otras proteínas útiles como la insulina, las hormonas de crecimiento y los anticuerpos monoclonales. En general, la aplicación de la clonación molecular continua por mejorar y crear desarrollos remarcables en el campo de la agricultura, la industria farmacéutica y la investigación biomédica.


Escrito por: Tyas Kroemer

Traducido por: Adriana Gallego


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