La transcripción inversa o reversa es una técnica utilizada por los investigadores para generar una hebra complementaria de ADN (ADNc) a partir de ARN. La tecnología se basa en un mecanismo retroviral mediante el cual la enzima transcriptasa inversa puede realizar la transcripción inversa del ARN en ADN. Esto es especialmente útil cuando los científicos solo tienen tejido y quieren estudiar la secuencia de genes. En esta situación, los investigadores pueden aislar el ARNm del tejido y luego usar la transcripción inversa para producir ADNc.

Este artículo explora los fundamentos de la tecnología de transcripción inversa, la síntesis de ADNc y las aplicaciones posteriores que utilizan la transcriptasa inversa.

Revisión de la Transcriptasa Inversa

La Ciencia Básica detrás de la Enzima Transcriptasa Inversa

En la naturaleza, la enzima transcriptasa inversa es lo que permite a los retrovirus (virus de tipo ARN) duplicarse e integrar sus genomas de ARN en un genoma de ADN de un organismo hospedero. La enzima tiene tres actividades bioquímicas que permiten este proceso: la actividad de la ADN polimerasa dependiente de ARN, la actividad de ribonucleasa H y la actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN (Bhagavan & Ha, 2015).

Una vez el virus entra en contacto con el huésped, el ARN viral y las enzimas que lo acompañan utilizan nucleótidos del huésped para ensamblar una sola hebra complementaria de ADN que se hibrida con la hebra de ARN original. La ARNasa H corta el híbrido ARN-ADN, lo que permite la formación de ADN de doble hebra utilizando la ADN polimerasa dependiente de ADN. Con la ayuda de la enzima integrasa, la nueva hebra de ADN se incorpora al genoma del huésped (Bhagavan & Ha, 2015).

Uso de la Transcriptasa Inversa en Biología Molecular

El mecanismo que subyace la transcripción inversa ha expandido el mundo de la biología molecular al ayudar a los científicos a superar obstáculos anteriores al permitirles usar ARN como material de partida en lugar de ADN.

A partir de los productos de ADNc, podemos examinar la composición genética de diferentes tumores, realizar la PCR de manera tradicional y cuantitativa, expresar proteínas únicas, generar bibliotecas de secuencias de ADN que codifican proteínas importantes y mucho más.

Fuentes Virales de Transcriptasa Inversa

• Virus de la leucemia murina de Moloney (VLM-M): El VLM-M demuestra una alta eficacia al generar ADNc de longitud completa utilizando una secuencia de ARN larga (> 5 kb). Esto se debe a que la transcriptasa inversa del VLM-M tiene una actividad de RNasa H reducida. La ARNasa H es una enzima que se encarga de remover el ARN del híbrido ARN-ADN en la síntesis de ADNc, lo que permite que la ADN polimerasa produzca la segunda hebra de ADN.

El genotipo silvestre del VLM-M tiene una temperatura de reacción más baja que dificulta la realización de la transcripción inversa en ARN con una estructura secundaria fuerte. Sin embargo, existen variantes que reducen aún más la actividad de la ARNasa H. En comparación con la variante silvestre de VLM-M, la variante H menos (H-) es más termoestable, lo que permite una temperatura de reacción mucho más alta (55 ° C).

La transcriptasa inversa del VLM-M es ideal para ADNc, para sintetizar la primera hebra de ADNc, para RT-PCR y validación de expresión génica mediante PCR de transcripción inversa (RT-PCR).

Características generales de la transcriptasa inversa del VLM-M:

- Tamaño: 70 kDa

- Actividad de la ARNasa H: actividad reducida de la ARNasa H

- Temperatura de reacción: hasta los 55 °C

- Beneficios: La actividad de RNasa H es muy reducida, tiene tolerancia a altas temperaturas, y es ideal para la producción de ADNc de longitud completa

• Virus de la mieloblastosis aviar (VMA): La transcriptasa inversa del VMA es comúnmente utilizada en biotecnología, es adecuada para la síntesis de ADNc y también para la síntesis de la primera hebra de ADNc, además de que se usa en la secuenciación de RNA.

Debido a que la transcriptasa inversa del VMA puede soportar temperaturas más altas, a menudo se usa cuando el ARN tiene una estructura secundaria más fuerte. Sin embargo, las temperaturas de reacción más altas pueden desnaturalizar el ARN. Algunos protocolos combaten el problema de superar una estructura secundaria fuerte sin poner en peligro el ARN incorporando un paso rápido de desnaturalización y enfriamiento.

La transcriptasa inversa del VMA tiene naturalmente actividad RNasa H, que degrada el ARN del híbrido ARN/ADN.

Características generales de la transcriptasa inversa del VMA:

- Tamaño: subunidad α de 65 kDa, subunidad β de 95 kDa

- Actividad de la ARNasa H: ARNasa H+

- Temperatura de reacción: 25 °C - 58 °C. Óptimo entre 42 °C - 48 °C

- Beneficios: se utiliza con ARN que tiene una estructura secundaria fuerte.

Cómo Seleccionar la Transcriptasa Inversa para tu Experimento

Las diferentes transcriptasas inversas son adecuadas para diferentes situaciones. Esta sección destaca algunas aplicaciones y la mejor opción de transcriptasa.

Aplicaciones/Condiciones:

• RT-PCR de rutina - para una RT-PCR general, una enzima estándar debería funcionar bien.
• Trabajar con ARN de estructura secundaria compleja - considere usar una transcriptasa inversa de VMA.
• Construcción de bibliotecas de ADNc usando ARN largo - use una transcriptasa inversa VLM-M con actividad reducida de ARNasa H.
• Realización de RT-PCR o RT-qPCR en un solo paso - la mayoría de los kits disponibles utilizarán una transcriptasa inversa VLM-M con actividad de RNasa H reducida o una versión patentada de esta transcriptasa inversa. Cuando se realiza RT-PCR o RT-qPCR en un solo paso, la transcriptasa inversa VLM-M con la actividad de RNasa H reducida generalmente será una buena opción.

¿Debería hacer una RT-PCR / RT-qPCR en uno o dos pasos?

Hay algunas formas sencillas de ayudar a delimitar qué método debe elegir para RT-PCR o RT-qPCR, y todo se reduce a los requisitos de sensibilidad, el tamaño, la complejidad del experimento, y la cantidad de tiempo disponible del que dispone. Hay varios kits en el mercado que incluyen una transcriptasa inversa adecuada para procesos de uno y dos pasos.

• Los procesos de PCR en un solo paso tienen muchas ventajas. Dan resultados consistentes, el protocolo es simple y rápido y hay menos pipeteo. Sin embargo, esta técnica es menos sensible y no es posible optimizar las reacciones individualmente. El proceso tampoco proporciona un stock para ADNc.

Elija RT-PCR de un sólo paso cuando:

• Realices experimentos de alto rendimiento ya que requieren que trabajes rápido
• Una menor sensibilidad no es tan preocupante
• Estés trabajando con muchas muestras de ARN
• No necesitas un stock de ADNc

• Los procesos de PCR en dos pasos son extremadamente flexibles y permiten un mejor control de tu experimento. Esta técnica permite la optimización individual de la síntesis de ADNc y la reacción de PCR. Es más sensible en comparación con el método en un solo paso. Debido a que se utilizan cebadores aleatorios, el método en dos pasos a menudo se ejecuta de manera más eficiente y proporciona ADNc de reserva que permite la toma de alícuotas y su uso en múltiples ensayos. El método en dos pasos tarda mucho más en realizarse e implica mucho más pipeteo.

Elija RT-PCR de dos pasos cuando:

• Running smaller experiments, and time is more available
• Your experiment requires higher sensitivity
• Estés ejecutando experimentos más pequeños, y hay mayor disponibilidad de tiempo
• Tu experimento requiere una mayor sensibilidad
• Trabajas con menos muestras de ARN
• Te gustaría generar un stock de ADNc para múltiples análisis y ensayos

Importancia del ADNc

Use de ADNc en Biotecnología

El dogma central de la biología establece que la información genética se transmite primero del ADN, luego al ARN y luego se utiliza para la producción de proteínas. La transcripción inversa y la síntesis de ADNc permiten a los científicos trabajar hacia atrás, decodificando información vital sobre proteínas y mutaciones de proteínas. Sin embargo, el valor del ADNc va más allá.

Los investigadores pueden utilizar el ADNc para la cuantificación del ARN, proteger la composición genética de una especie en peligro de extinción, profundizar en investigación clínica, comprender el ARNm y las proteínas involucradas durante una etapa de desarrollo determinada, y mucho más.

Al poder crear bibliotecas de ADNc, los científicos pueden estudiar secuencias específicas de un tejido determinado y desarrollar bases de datos compartibles.

Librerías de ADNc

Las bibliotecas de ADNc se basan en complementos de ARNm y representan la composición de ARNm dentro de una célula o tejido determinados. Las bibliotecas proporcionan mucha información sobre la identidad y funcionalidad de genes específicos. Las bibliotecas también proveen información proporcional sobre la abundancia de ARN producido en una célula o tejido dado, porque cuanto más se expresa un ARNm, más ADNc se producirá y viceversa.

Las bibliotecas de ADNc se diferencian de las bibliotecas genómicas en las siguientes formas:

1. El ARNm es el material de partida para las bibliotecas de ADNc. Por lo tanto, las bibliotecas de ADNc solo tendrán secuencias para el ARNm de un tejido en particular.
2. Una biblioteca genómica puede tener un clon para todos los genes de un organismo. Una biblioteca de ADNc no lo tendrá.
3. Las bibliotecas de ADNc proporcionan información sobre los niveles de expresión de ARNm. Una biblioteca genómica sólo nos ofrecerá información de la representación de genes, ya que ellos ocurren en el cromosoma.

Un beneficio del ADNc y las bibliotecas de ADNc y que es otro punto de separación de las bibliotecas genómicas, es que el ADNc no tiene intrones. Esto es extremadamente útil cuando se utilizan organismos procarióticos para la clonación, ya que no tienen capacidades de empalme.

Escaneo de una Librería de ADNc

Así como una biblioteca tradicional puede tener un libro de interés, una biblioteca de ADNc contendrá copias de un gen de interés, así los investigadores necesitan una forma de identificar ese gen.

Existen muchas colonias en una placa maestra de una biblioteca de ADNc, ya que la biblioteca contiene la representación del ARNm de un tejido o célula determinados. Aquí es donde entra en juego la selección de bibliotecas. A continuación, se muestran algunos procesos de selección destacados de bioología altamente calificada de Shomu en Youtube:

• Hibridación de colonias: esta técnica identifica el ADN de interés mediante una sonda radiomarcada que se une a la secuencia objetivo. La hibridación será útil cuando se conoce la secuencia del gen de interés.

En este método de escaneo, se utiliza un papel de filtro de nailon para replicar una placa maestra que contiene colonias (cada colonia contiene una población homogénea de plásmido cerrado idéntico). El papel se presiona sobre la placa maestra, transfiriendo así las células de las colonias de la placa maestra al papel de nailon. El papel de filtro se trata con una solución alcalina para lisar las células y desnaturalizar el ADN. Luego, se agregan sondas radiomarcadas que contienen oligos complementarios de la secuencia diana. Las sondas se hibridan con el ADN de las células lisadas. Luego, el papel de filtro se expone a rayos X que, una vez revelados, permitirán la visualización del objetivo y nos permitirá hacer una comparación entre el papel de nailon etiquetado y la placa maestra para encontrar las colonias que contienen nuestro ADN de interés. A continuación, las colonias seleccionadas se recogen y se cultivan en un medio nutritivo.

1. Detección con sondas de oligonucleótidos marcados: este método va a ser útil cuando no se conozca la secuencia de ADN. Es similar en muchos aspectos a la hibridación de colonias; sin embargo, esta técnica se basa en la secuencia de péptidos más que en la secuencia de ADN. A partir de la secuencia de péptidos, un investigador puede encontrar la posible secuencia de ADN, producir una secuencia complementaria y usarla como sonda / cebador. A partir de ahí, el resto de la técnica sigue la hibridación de colonias.

• Escaneado inmunológico: este proceso utiliza anticuerpos primarios y secundarios para identificar las colonias de interés. Aquí, se coloca papel de nitrocelulosa en la placa de Petri donde se unen las proteínas. La nitrocelulosa se incuba primero con el anticuerpo primario y luego con un anticuerpo secundario radiomarcado. Después del revelado, la ubicación relativa de la colonia de interés se puede determinar utilizando la película expuesta a rayos X como guía.

• Escaneado sustractivo: los métodos anteriores permiten a los investigadores comenzar con algún tipo de conocimiento conocido para escanear su biblioteca. El escaneado sustractivo, sin embargo, es capaz de identificar la nueva expresión génica a partir del ARNm. Por ejemplo, se cree que la exposición a un nuevo tratamiento farmacológico o contaminante ambiental induce una expresión genética única de un control. El escaneado sustractivo (también llamado escaneado diferencial) ayuda a examinar esta expresión única y, en última instancia, permite a los investigadores comparar el ADN en cuestión con un control para encontrar una diferencia en la expresión.

Aplicaciones que involucran el ADNc y la Transcripción Inversa

La transcripción inversa es la clave para obtener el ADN inicial (ADNc) que luego se puede utilizar en una serie de aplicaciones para estudiar más a fondo un gen.

• RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa) - en pocas palabras, esta es una PCR donde el ARN es el material de partida. Usando transcriptasa inversa, el ARNm se transcribe de manera inversa en ADNc que luego puede usarse como plantilla para la amplificación por PCR.

Hay opciones para los kits tradicionales de RT-PCR y para los kits de un Solo Paso. Los kits de Un Solo Paso son extremadamente fáciles de usar, ya que implican el establecimiento de reacción con una plantilla de ARN, una transcriptasa inversa y una mezcla de PCR, de modo que el ADNc se sintetiza y se amplifica.

• RT-qPCR (PCR cuantitativa de transcripción inversa) - al igual que la RT-PCR, la definición de RT-qPCR es simplemente una PCR cuantitativa que involucra ARN como material de partida inicial. Este método se puede realizar en uno o dos pasos.

La RT-qPCR de Un Solo Paso presenta resultados más consistentes, tiene menos pasos y es ideal para amplificaciones de alto rendimiento. Una de las principales desventajas es la incapacidad de individualizar y optimizar cada proceso (síntesis de ADNc y PCR). El proceso de un solo paso también puede tener una sensibilidad reducida.

La realización de la RT-qPCR de Dos Pasos (síntesis de ADNc seguida de qPCR) permite una mejor optimización experimental.

El ADNc sintetizado también permite a los investigadores realizar la purificación y expresión de proteínas, y el perfil de expresión génica.

Referencias

Bhagavan, N. V., & Ha, C. (2015). Essentials of medical biochemistry: With clinical cases. Amsterdam: Academic Press. doi:10.1016/b978-0-12-416687-5.00022-1

Biology, S. (2013, October 26). Retrieved June, 2019, from https://www.youtube.com/watch?v=2nFfxah8RO8

Biology, S. (2015, November 25). Retrieved June, 2019, from https://www.youtube.com/watch?v=fmMp6avlB6I

Biology, S. (2016, February 15). Retrieved June 14, 2019, from https://www.youtube.com/watch?v=6qeFf2gXhkQ

Bremgartner, M. (2016, October 26). Retrieved June, 2019, from https://www.youtube.com/watch?v=ta69UIVcEvU

CDNA (Complementary DNA). (n.d.). Retrieved June, 2019, from http://humangenes.org/cdna-complementary-dna

Coffin, J. M., Hughes, S. H., & Varmus, H. E. (Eds.). (1997). Overview of Reverse Transcription. Retroviruses. Retrieved June, 2019, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19424/#__NBK19424_dtls__.

Liu, C., Lu, T., Feng, B., Liu, D., Guan, W., & Ma, Y. (2010). Construction of cDNA library and preliminary analysis of expressed sequence tags from Siberian tiger. Retrieved June, 2019, from http://www.ijbs.com/v06p0584.htm

Eberwine, J., Spencer, C., Miyashiro, K., Mackler, S., & Finnell, R. (1995). Complementary DNA Synthesis in Situ: Methods and Applications. Recombinant DNA Methodology II,3-23. doi:10.1016/b978-0-12-765561-1.50007-2

Gonzales, M. (2010, February). RTPCR (Reverse Transcription, PCR). Retrieved June, 2019, from http://fg.cns.utexas.edu/fg/protocol__RTPCR.html

Goodsell, D. (2002, September). PDB101: Molecule of the Month: HIV Reverse Transcriptase. Retrieved June, 2019, from https://pdb101.rcsb.org/motm/33

How To Get The Best cDNA For Gene Isolation. (2015, June 08). Retrieved June, 2019, from https://bitesizebio.com/650/how-to-get-the-best-cdna-for-gene-isolation/

Hu, P., Li, X., Liu, H., Guan, W., & Ma, Y. (2014). Construction and characterization of a cDNA expression library from the endangered Hu sheep. Genetics and Molecular Research,13(4), 9019-9023. doi:10.4238/2014.october.31.16

Isolation and use of cDNA clones. (n.d.). Retrieved June, 2019, from http://www-users.med.cornell.edu/~jawagne/cDNA_cloning.html

Khanacademymedicine. (2015, March 25). Retrieved June, 2019, from https://www.youtube.com/watch?v=aQxyXfIfa9A

McClean, P. (1997). Clone Library Screening. Retrieved June, 2019, from https://www.ndsu.edu/pubweb/~mcclean/plsc431/cloning/clone5.htm

Namuth-Covert, D. (n.d.). Gene Cloning Part 1: The Mechanics of Recombinant DNA. Retrieved June, 2019, from https://passel.unl.edu/communities/index.php?idinformationmodule=959197140&topicorder=15&maxto=16&minto=0&idcollectionmodule=1130274210

Perbal, B. (2008). Avian myeoloblastosis virus (AMV): Only one side of the coin. Retrovirology,5(1), 49. doi:10.1186/1742-4690-5-49

Provenzano, M., & Mocellin, S. (2007). Complementary techniques: Validation of gene expression data by quantitative real time PCR. Adv Exp Med Biol,66-73. doi:10.7287/peerj.6522v0.1/reviews/1

Reverse Transcriptase. Choosing The Best RT-qPCR Method. (2019, March 15). Retrieved June, 2019, from https://bitesizebio.com/33640/rt-qpcr-reverse-transcription-methods/

Schultz, S., & Champoux, J. (2008). RNase H Activity: Structure, Specificity, and Function in Reverse Transcription. Virus Research,86-103. Retrieved June, 2019, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2464458/.

Sterling, C. H., Veksler-Lublinsky, I., & Ambros, V. (2014). An efficient and sensitive method for preparing cDNA libraries from scarce biological samples. Nucleic Acids Research,43(1). doi:10.1093/nar/gku637

Tanese, N., & Goff, S. P. (1988). Domain structure of the Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase: Mutational analysis and separate expression of the DNA polymerase and RNase H activities. Proceedings of the National Academy of Sciences,85(6), 1777-1781. doi:10.1073/pnas.85.6.1777

Weinberg, E., & Dorkin, R. (n.d.). CDNA Libraries and Expression Libraries. Retrieved June, 2019, from https://ocw.mit.edu/courses/biology/7-01sc-fundamentals-of-biology-fall-2011/recombinant-dna/cdna-libraries-and-expression-libraries/#?w=535

Wu, N., Matand, K., & Williams, S. (2009). A Novel mRNA Level Subtraction Method for Quick Identification of Target-Orientated Uniquely Expressed Genes Between Peanut Immature Pod and Leaf. Biological Procedures Online,12(1), 44-55. doi:10.1007/s12575-009-9022-z.

Escrito por: Katharine Martin

Traducido por: Adriana Gallego, Ph.D.