¿Cómo funciona la inducción de IPTG?

unque hayas utilizado IPTG para tus experimentos, es posible que no estés familiarizado con el mecanismo de inducción de IPTG. Este artículo proporciona una revisión rápida del principio de inducción de IPTG, cuánto IPTG se debe usar para la inducción y los protocolos para la inducción de IPTG.

¿Qué es IPTG?

IPTG o isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido es un análogo molecular de la allolactosa, el cual elimina un represor del operón lac para inducir la expresión génica.

Alolactosa es un isómero de lactosa, que se forma cuando la lactosa ingresa a las células. Actúa como inductor para iniciar la transcripción de genes en el operón lac. Los genes del operón lac codifican proteínas importantes para descomponer la lactosa.

El metabolismo de la lactosa ocurre cuando la glucosa está ausente y la lactosa está presente en niveles altos. Para reponer la fuente de energía, las células descomponen naturalmente la lactosa.

¿Qué es el operón lac?

El operón lac es una región de ADN de la bacteria Escherichia coli, que contiene tres genes (lacZ, lacY y lacA). Los tres genes, que operan bajo un solo promotor, se agrupan en el genoma de E. coli. Un promotor es un sitio donde la ARN polimerasa inicia la transcripción de un gen.

Cuando no hay lactosa, un represor se une a un operador lac, bloqueando la ARN polimerasa e impidiendo la transcripción de los genes. Un operador lac es un sitio regulatorio negativo en el ADN, que se superpone sobre un promotor lac.

Cuando no hay glucosa y hay lactosa, la alolactosa se une al represor lac para liberarlo del operador lac. De manera similar a la alolactosa, IPTG provoca la liberación del represor lac. Como resultado, la ARN polimerasa se une al promotor y comienza la transcripción del gen.

¿Qué es la inducción de IPTG?

La inducción de IPTG es un método para regular la síntesis de proteínas activando la transcripción del operón lac. La inducción requiere dos jugadores clave:

Células

Durante la inducción de IPTG, las células deben producir la ARN polimerasa T7 necesaria para la transcripción de genes; por ejemplo, puedes utilizar la cepa de E. coli BL21(DE3). La cepa BL21 (DE3) contiene el gen lacI que codifica el represor lacI. Después de la inducción de IPTG, esta cepa expresa la ARN polimerasa de T7.

Vector

En el paso de clonación, clona tu gen de interés en un vector particular, como el vector pET, y transforma luego las células de E. coli con el ADN recombinante.

Para expresar tu gen de interés, tu vector debe contener varios elementos clave:

• Un gen de resistencia a antibióticos: para seleccionar las células transformadas.
• El gen lacI: para sintetizar el represor lac, LacI.
• Sitio LacO: un sitio que contiene una secuencia de operador lac. En ausencia de IPTG, LacI se une a este sitio para prevenir la expresión de tu gen de interés.
• Promotor T7 (u otros promotores reconocidos por la ARN polimerasa T7): para iniciar la transcripción de tu gen de interés. Este promotor es adyacente al sitio LacO. Por lo tanto, cuando LacI se une al sitio LacO, evita la unión de la ARN polimerasa de T7 en el promotor de T7.
• ORF (Marco de Lectura Abierta, o en inglés Open Reading Frame): es un sitio donde clonas tu gen de interés.

Cuánto IPTG agregar para la inducción

Un protocolo de uso común especificaría cuánto IPTG agregar al medio de crecimiento que contiene el cultivo bacteriano. Para los protocolos de GoldBio, utiliza 1 mM de IPTG en 1 ml de medio LB para obtener una concentración final de 0,5 mM en el medio con cultivo bacteriano. Esta concentración es suficiente para inducir tu proteína de interés.

¿Cuánto tiempo toma expresar una proteína para la inducción de IPTG?

Hay dos protocolos comunes para inducir proteínas mediante IPTG: inducción rápida e inducción lenta. Para una inducción rápida, puedes recolectar tu proteína de interés al menos 3-4 horas después de la inducción de IPTG. Mientras que, para una inducción lenta, puede obtener tu proteína al menos 12-16 horas después de la inducción de IPTG. La razón por la que preferirías la inducción lenta en lugar de la inducción rápida es que algunas proteínas son difíciles de obtener con la inducción rápida.

¿Por qué IPTG es mejor que la lactosa para la inducción?

Las células bacterianas no pueden procesar IPTG porque no es el sustrato adecuado para las vías metabólicas de la lactosa. Por lo tanto, IPTG permanece disponible en el medio de crecimiento para inducir la expresión de proteínas, en lugar de usarse como fuente de energía.

Protocolos de inducción de IPTG

A continuación se muestran los protocolos para la inducción rápida y la inducción lenta:

Inducción Rápida

1. Distribuya la cepa de E. coli transformada en una caja Petri y multiplique las colonias durante la noche a 37 °C.Seleccione una sola colonia y cultive las células en 15 ml de medio LB que contenga un antibiótico durante la noche en una incubadora con agitación.
2. Diluya 1:50 en 2 ml de medio LB con antibiótico y cultive por 3-4 horas a 37 °C en una incubadora con agitación (como alternativa, diluir 1: 100 si prefiere hacer crecer las células durante la noche a 37 °C).
3. Prepara 1 ml de LB con un antibiótico y 1 mM de IPTG en tubos cónicos de 15 ml y precaliéntalo durante 10 minutos a 37 °C antes de su uso.
4. Después de 3-4 horas, retire 1 ml del cultivo bacteriano y colóquelo en un tubo de 1,5 ml etiquetado. Gire a velocidad máxima durante 30 segundos a temperatura ambiente, elimina el sobrenadante y congela a -20 °C hasta que sea necesario. Este es el control no inducido.
5. Agrega 1 ml de LB precalentado + antibiótico + IPTG 1 mM en el tubo que contiene el cultivo bacteriano y permite que crezca a 37 °C durante 3-4 horas. En este tubo, el volumen total es de 2 ml y la concentración final de IPTG es de 0,5 mM.
6. Después de 3-4 horas después de la inducción de IPTG, transfiere 1 ml a tubos etiquetados de 1,5 ml y centrifuga a velocidad máxima a temperatura ambiente durante 30 segundos. Retira el sobrenadante y congela el sedimento a -20 °C hasta que sea necesario. Este es el control inducido.
7. Prepara luego la muestra para una electroforesis de poliacrilamida (SDS-page).

Inducción lenta

1. Siga los pasos 1-4 del protocolo de inducción rápida.
2. Agrega 1 ml de LB + antibiótico + IPTG 1 mM (precalentado a 20 °C) en el tubo que contiene el cultivo bacteriano y permite que crezca a 20 °C durante 12 a 16 horas. En este tubo, el volumen total es de 2 ml y la concentración final de IPTG es de 0,5 mM.
3. Después de 12-16 horas después de la inducción de IPTG, transfiere 1 ml de la muestra inducida a tubos etiquetados de 1,5 ml y centrifuga a velocidad máxima durante 30 segundos a temperatura ambiente. Retira el sobrenadante y congela el sedimento a -20 °C hasta que sea necesario. Este es el control inducido.
4. Prepare luego la muestra para una electroforesis de poliacrilamida (SDS-page).

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Escrito por: Tyasing Kroemer, Ph.D.

Traducido por: Adriana Gallego, Ph.D.