Desde muy temprano en los años de 1970, las enzimas de restricción han sido una parte importante en la clonación y muchas otras aplicaciones, incluyendo mapeo de ADN. Las enzimas de restricción son enzimas que cortan el ADN en o cerca de una secuencia diana, llamada sitio de restricción.

La mayor parte del tiempo, como investigador no puedes evitar usar enzimas de restricción en tu experimento de clonación con ADN. Pero, llevar a cabo experimentos de clonación de ADN con enzimas de restricción no es tan fácil como parece. Algunas veces no puedes evitar obtener colonias blancas en tu caja Petri, incluso después de seguir estrictamente el protocolo paso a paso. Es por tanto que en este artículo, revisaremos a profundidad la clonación basada en enzimas de restricción, introduciremos algunos de los desafíos comúnmente encontrados y daremos algunas ideas de cómo resolver estas situaciones.




Fragmentos de ADN con extremos cohesivos y romos

El primer paso antes de clonar es escoger qué enzimas de restricción usar, y el tipo de productos a digerir que deseas.

La digestión por enzimas de restricción puede generar extremos cohesivos o extremos romos en un fragmento de ADN. Los extremos cohesivos tienen colas cortas de cadena sencilla (o salientes) en cada extremo del fragmento de ADN. Cuando los extremos cohesivos son complementarios a los extremos digeridos de tu vector, entonces puedes fácilmente ligar (unir, conectar) el fragmento de ADN con el vector.

Fragmento de ADN con extremos cohesivos. 1. La enzima de Restricción EcoRI digiere el fragmento de ADN en un sitio de restricción. 2. El ADN digerido tiene salientes de cadena sencilla (extremos cohesivos).

Abajo encontrarás la lista de las enzimas de restricción comúnmente usadas que generan extremos cohesivos:

Producto final

Enzima de Restricción

Sitio de Restricción

Extremos cohesivos

BamHI

G/GATCC


BglII

A/GATCT


ClaI

AT/CGAT


EcoRI

G/AATTC


HindIII

A/AGCTT


PstI

CTGCA/G


SalI

G/TCGAC


XmaI

C/CCGGG



Los extremos romos no generan salientes en ninguno de los extremos del fragmento de ADN digerido. No existe un requerimiento para los extremos romos de un fragmento de ADN que los haga complementarios con otros extremos de ADN para ligación. No obstante, los extremos romos son más difícil de ligar que los extremos cohesivos.

Digestin con la enzima de restriccion

Fragmento de ADN con extremos romos. 1. La enzima de Restricción EcoRV digiere el fragmento de ADN en un sitio de restricción. 2. El fragmento de ADN digerido no tiene salientes (extremos romos).

Abajo encontrarás una lista de las enzimas de restricción comúnmente usadas que generan extremos romos:

Producto final

Enzima de Restricción

Sitio de Restricción

Extremos romos

DraI

TTT/AAA


EcoRV

GAT/ATC


HaeIII

GG/CC


PmeI

GTTT/AAAC


PvuII

CAG/CTG


RsaI

GT/AC


SmaI

CCC/GGG


StuI

AGG/CCT




Método de Clonación Basado en Enzimas de Restricción

La clonación basada en enzimas de restricción es dependiente de dos cosas: La primera, es que esto depende de la habilidad de la enzima de restricción para ¨cortar¨ ambos fragmentos de ADN, es decir, el fragmento y el vector. La segunda, es que la clonación basada en enzimas de restricción requiere de la enzima ligasa para ¨pegar¨ el fragmento de ADN dentro del vector. Este método es relativamente más barato comparado a otros métodos de clonación.



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Clonación de ADN basada en Enzimas de Restricción. 1. Secuencias cortas que contiene sitios de restricción se adicionan a cebadores o primers 5’ durante la amplificación de ADN por PCR. 2. Tanto el vector como el fragmento de ADN son digeridos con enzimas de restricción para crear extremos cohesivos. 3. El vector y el fragmento de ADN son ligados. 4. El ADN recombinante entra a la célula hospedera durante la transformación.



Seis Pasos para la Clonación Basada en Enzimas de Restricción

1. Preparación del Vector

Durante el paso de preparación del vector, una o dos enzimas de restricción digieren el vector en el Sitio de Clonación Múltiple (SCM) generando extremos cohesivos o extremos romos. Después de la digestión, el vector es purificado para ser usado en la electroforesis en gel.

Puedes prevenir que el vector se auto-ligue durante la ligación del fragmento de ADN y el plásmido con un paso extra. Este paso involucra fosfatasas alcalinas, las cuales remueven los grupos fosfato del extremo 5’ del vector.


2. Preparación del Fragmento de ADN

Necesitarás adicionar sitios de restricción a tu fragmento de ADN. Para adicionar estos sitios de restricción necesitarás usar la PCR. Específicamente, los cebadores o primers son diseñados con estas secuencias de restricción que son luego incorporadas a tu fragmento de ADN.

Cuando el paso de PCR está completo, debes digerir los productos de PCR usando la misma enzima de restricción como la usada durante el paso de preparación del vector. Posteriormente, debes purificar los productos digeridos usando electroforesis en gel.


3. Ligación

Para realizar la ligación, mezcla el fragmento de ADN y el vector purificados y luego adicionas la ADN ligasa.


4. Transformación

Después de que la reacción de ligación se finalice, selecciona células bacterianas química o eléctricamente competentes para llevar a cabo la transformación. La transformación es la introducción de ADN recombinante al interior de la bacteria. Puedes usar tratamiento por calor para células químicamente competentes o electroporación para células electrocompetentes.

Para mayor información acerca de las diferencias entre los tipos de células competentes, te invitamos a revisar nuestro artículo “Introducción a las Células Competentes”



5. Selección de colonias con el plásmido

La bacteria transformada puede ser cultivada en medio de cultivo y agar en cajas Petri conteniendo el agente antibiótico de selección. Sólo la bacteria que lleva el vector sobrevive a esta selección. Te invitamos a mirar nuestro artículo “Una Revisión General sobre Clonación Molecular” para más información sobre cómo la selección de antibiótico y clonación molecular funciona.


6. Escanee los clones usando la selección de colonias blancas y azules

Escane los clones con su ADN recombinante deseado exponiendo la bacteria a X-Gal y IPTG (método de selección de colonia azul y blanca) y colecte solo las colonias blancas. En GoldBio tenemos un gran protocolo disponible con detalles de cómo realizar el escaneo azul-blanco de bacterias.

https://youtu.be/-FtKJVchtzg

Para posteriormente confirmar la presencia del fragmento correcto de ADN en el plásmido de aquellas colonias blancas seleccionadas, debes realizar un escaneo por PCR, una digestión por enzimas de restricción o un secuenciamiento de ADN. Después de escanear las colonias deseadas, puedes crecer los clones usando un medio líquido y extraer el ADN recombinante para futuras aplicaciones.




Resolución de Problemas para Clonación basada en Enzimas de Restricción

Abajo te presentamos seis problemas comunes en clonación y tips de cómo resolverlos:

1. Digestión Incompleta o No Digestión Del Producto De PCR

  • Verifica si tu enzima de restricción es funcional.
  • Adiciona nucleótidos extra en el extremo 5’ de los sitios de restricción de sus primers o cebadores y luego verifique la secuencia del sitio de restricción para asegurarse que no existen mutaciones.
  • Usa una longitud de onda larga o luz UV durante la excisión del gel de agarosa.
  • Purifica tu producto de PCR de sales, cebadores, ADN polimerasa, y posibles inhibidores de enzimas de restricción. Una forma de remover contaminantes es llevar a cabo una precipitación con etanol.
  • Usa una incubación óptima de temperatura y un buffer compatible con la enzima de restricción.
  • Incrementa el tiempo de incubación para la digestión.


2. Digestión Incompleta o No Digestión del Plásmido

  • Verifica si tu enzima de restricción es funcional.
  • Verifica si la actividad de tu enzima de restricción está bloqueada por metilación de ADN en el sitio de restrición diana. La metilación de ADN es la adición de grupos metilo a el ADN por la enzima ADN metiltransferasa para proteger el ADN. Algunas enzimas de restricción tales como AvaI, AvaII, y ClaI, no pueden reconocer ni cortar sitios de restricción metilados. Si debes usar estas enzimas que son sensibles a sitios de restricción metilados, es mejor que escojas una cepa de Escherichia coli libre de ADN metiltransferasa para transformación.
  • Purifa tu plásmido de sales y otros inhibidores de enzimas de restricción.
  • Usa una temperatura de incubación óptima y un buffer compatible para la enzima de restricción.
  • Incrementa las unidades de enzimas y el tiempo de incubación.


3. Bandas Inesperadas Después de la Digestión

  • Escoje las enzimas de restricción sin su actividad estrella. Una actividad estrella es una actividad cambiada por una enzima de restricción cuando esto corta secuencias casi similares a su sitio de restricción.
  • Decrece las unidades de enzima y el tiempo de incubación.
  • Purifica tu fragmento de ADN y tu plásmido antes de la digestión.


4. Muchas Colonias con Vectores Vacíos (La Reacción De Ligación Fragmento De ADN-Vector No Ocurrió)

  • Trata tu plásmido lineal con una Fosfatasa Alcalina antes de la ligación. La fosfatasa alcalina remueve los grupos fosfatos de los extremos 5’ del vector de ADN, así previene que el vector se auto-ligue durante la ligación.
  • Incrementa el tiempo de incubación y asegúrate que la digestión esta completa.


5. No Hay Colonias O Hay Muy Pocas Colonias

  • Verifica si tu ligasa es todavía funcional y si es inactivada por calor.
  • Calcula la eficiencia de transformación de las células. Si la eficiencia es muy baja, usa células competentes comercialmente, e inicia de nuevo la transformación.
  • Incrementa la eficiencia de ligación usando una relación diferente de fragmento de ADN y plásmido.
  • Incrementa el tiempo de incubación y usa una menor temperatura.
  • Usa la cantidad correcta de ligasa.
  • Purifica tu fragmento de ADN y plásmido de inhibidores de ligación.


6. Alto Contenido De Colonias Sin Plásmido

  • Incrementa la concentración de tu antibiótico.
  • Reduce el tiempo de incubación de la caja Petri (no más de 16 horas).
  • Evalúa si tus antibióticos son funcionales con el Método de Difusión de Disco (Test de Kirby-Bauer).

https://youtu.be/sx1uDYSfINA

Este artículo cubre una rápida revisión acerca de la clonación basada en enzimas de restricción, problemas comunes de clonación que puedes encontrar durante la clonación basada en enzimas de restricción y algunos tips para resolverlos. Aunque este artículo solo lista algunos de los muchos problemas de clonación, esperamos que estos tips puedan ser un buen comienzo para conquistar tus experimentos de clonación.



REFERENCIAS

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Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., Boyer, H. W., & Helling, R. B. (1973). Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids In Vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences, 70(11), 3240. doi:10.1073/pnas.70.11.3240

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Escrito por: Tyas Kroemer

Traducido por: Adriana Gallego