La transformación es un método común en biología molecular con muchas aplicaciones, incluida la clonación, la secuenciación de ADN y la construcción de bibliotecas de ADN. Para realizar la transformación, debes utilizar células competentes. Este artículo proporciona información sobre cómo usar células competentes, tipos de células competentes, los pasos comunes para producir células competentes y almacenamiento de células competentes.


3 Pasos Básicos de Transformación

Existen tres pasos básicos en muchos protocolos para transformar células bacterianas (Aune & Aachmann, 2010):

1. El paso de preparación: las células bacterianas se vuelven competentes para absorber ADN extraño modificando la permeabilidad de la membrana celular y la pared celular.

Paso de preparacion



2. El paso de transformación: el paso de transformación se realiza para permitir que el ADN (generalmente ADN plasmídico) ingrese a la célula. Los métodos de transformación más comunes son la electroporación o la transformación por choque térmico.



El paso de transformación: el paso de transformación se realiza para permitir que el ADN (generalmente ADN plasmídico) ingrese a la célula. Los métodos de transformación más comunes son la electroporación o la transformación por choque térmico.

3. El paso de recuperación: las células se incuban en un medio de recuperación para restaurar la membrana celular y la pared celular.



Paso de recuperacion


Electroporación vs. Transformación por Choque Térmico

Las ventajas de usar la electroporación son: mayor eficiencia, más colonias y transformaciones mucho más rápidas en comparación con el método de choque térmico.

Las eficiencias de transformación para la electroporación son 5.0 x 109 – 2.0 x 1010 CFU/µg de ADN, mientras que las eficiencias para la transformación por choque térmico son de 1.0 x 105 – 2.0 x 109 CFU/µg de ADN (Aune y Aachmann, 2010). Por lo tanto, la electroporación es útil cuando tienes que construir bibliotecas de ADN.

El inconveniente de este método es que debes contar con un electroporador, que es un equipo especial. Además, el problema común durante la electroporación es la presencia de sales o burbujas de aire en tu ADN, y en la cubeta, lo que pueden causar un arco eléctrico (el arco eléctrico generalmente ocurre cuando un circuito se sobrecarga y se sobrecalienta). Desafortunadamente, esto te hará perder tu muestra y requerirá que hagas de nuevo la reacción de ligación.

Para obtener más información sobre cómo prevenir un arco eléctrico, busca en nuestro artículo de GoldBio:

Problemas con Electroporación: Domina la Electroporación y Evita un Arco Eléctrico

La transformación por choque térmico es relativamente fácil en comparación con la electroporación. También es simple, solo requiere un baño maría. Puedes utilizar este método cuando sólo necesites obtener unos pocos clones positivos.

Para realizar la transformación, debes tener células competentes. Hay dos tipos de células artificialmente competentes disponibles: electrocompetentes y químicamente competentes. Lo que se usa para la electroporación son células electrocompetentes, mientras que las células químicamente competentes se usan para el método de transformación por choque térmico.


Qué son las Células Electrocompetentes y las Células Químicamente Competentes?

Las células competentes son células bacterianas que se utilizan habitualmente para la transformación. La transformación de bacterias implica la unión de ADN extraño a la membrana celular y el movimiento de ADN a través de la membrana hacia el citoplasma.

Células Electrocompetentes y las Células Químicamente Competentes

En la electroporación, un pulso eléctrico crea poros y un campo eléctrico temporal. El campo eléctrico hala el ADN hacia el extremo más cargado positivamente o hacia el interior de la célula. Cuando se apaga el campo eléctrico, la membrana celular se vuelve a sellar y el ADN queda atrapado dentro de la célula (Carter & Shieh, 2015).

La preparación de células electrocompetentes es relativamente más fácil que la fabricación de células químicamente competentes. En lugar de sales, se usa comúnmente glicerol al 10% refrigerado. El glicerol, que se utiliza para un lavado exhaustivo, elimina las sales restantes de la suspensión de gránulos. Este enfoque libre de sales ayuda a prevenir la formación de arcos eléctricos y proporciona una alta eficiencia de transformación (Sharma & Schimke, 1996).

Durante la transformación por choque térmico, el pulso de calor disminuye el potencial de membrana de las células competentes, por lo que disminuye la barrera potencial para el movimiento de ADN cargado negativamente hacia el citoplasma (Panja et al., 2006).

Para producir células químicamente competentes, los sedimentos se tratan generalmente con sales, por ejemplo, usando CaCl2 o MgCl2. Este tratamiento con sal neutraliza las cargas negativas de la bicapa de fosfolípidos y el ADN, lo que permite que el ADN se mueva más cerca de la célula.

Para obtener más detalles sobre las células competentes, busque el artículo de GoldBio a continuación:

Introducción a las Células Competentes

Cómo Hacer Células Competentes

Aquí hay una descripción general sobre cómo hacer células competentes.

  • Prepare todas las soluciones, incluyendo el medio LB y las soluciones salinas o la solución de glicerol para tratar sus células.
  • Distribuya la cepa de E. coli en una caja Petri y deje crecer las células durante la noche a 37 °C.
  • Recoja las células de una sola colonia e inocule las células en 5 ml de medio LB durante la noche en una incubadora con agitación.
  • Pipetee 1 mL del cultivo en 99 mL de Medio LB (dilución 1: 100, sin antibiótico) en un matraz.
  • Haga crecer el cultivo de células bacterianas hasta la fase logarítmica temprana o media en una incubadora con agitación. Suele tener un DO600 de 0,4.
  • Centrifugue el cultivo a 6000 rpm durante 5 minutos y decante el sobrenadante.
  • Trate posteriormente el pellet de células con glicerol para que hacerlas competentes para la electroporación o con sales para la transformación por choque térmico.

Cómo Almacenar Las Células Competentes

Las células competentes GoldBio se envían en hielo seco. Una vez recibidas, se deben almacenar inmediatamente en congelador a -80 °C. Si almacena las células a -20 °C, la eficiencia de transformación de las células disminuirá drásticamente.

Cuánto Tiempo se Pueden Almacenar las Células Competentes

Cuando se almacenan y manipulan correctamente, las células competentes GoldBio deben permanecer estables a -80 °C durante al menos 1 año.

Cuánto tiempo pueden Permanecer las Células Competentes en Hielo

Antes de usar, descongele y mantenga las células competentes en hielo. Incube las células descongeladas con un ADN plasmídico en hielo durante 30 minutos antes de la transformación (o un tiempo particular sugerido por su protocolo) para lograr una eficiencia de transformación óptima (Liu et al., 2014).

Por qué las Células Competentes se Deben Conservar en Hielo

La preparación celular competente antes de la transformación debe mantenerse a baja temperatura. Esta baja temperatura ayuda a mantener la permeabilidad de la membrana celular y, por lo tanto, mantiene una alta eficiencia para la absorción de ADN.

¿Puedes Volver a Congelar tus Células Competentes?

No. Las células competentes son sensibles a los cambios de temperatura, por lo que debes evitar descongelar y volver a congelar las células para mantener la eficiencia de transformación de las células.


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Referencias

Aune, T. E. V., & Aachmann, F. L. (2009). Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed. Applied Microbiology and Biotechnology, 85(5), 1301–1313. https://doi.org/10.1007/s00253-009-2349-1.

Barrick Lab :: ProtocolsElectrocompetentCells. (n.d.). Barricklab.Org. Retrieved September 16, 2020, from https://barricklab.org/twiki/bin/view/Lab/ProtocolsElectrocompetentCells.

Carter, M., & Shieh, J. (2015, January 1). Chapter 11 - Gene Delivery Strategies (M. Carter & J. Shieh, Eds.). ScienceDirect; Academic Press. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128005118000113.

Chang, A., Chau, V., & Landas, J. (n.d.). Preparation of calcium competent Escherichia coli and heat-shock transformation. 1, 22–25. https://jemi.microbiology.ubc.ca/sites/default/files/Chang%20et%20al%20JEMI-methods%20Vol%201%20pg%2022-25.pdf.

Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., & Provenzano, D. (2013). Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. Journal of Visualized Experiments : JoVE, 80. https://doi.org/10.3791/50684.

Inoue, H., Nojima, H., & Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96(1), 23–28. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90336-p.

Panja, S., Saha, S., Jana, B., & Basu, T. (2006). Role of membrane potential on artificial transformation of E. coli with plasmid DNA. Journal of Biotechnology, 127(1), 14–20. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2006.06.008.

Liu, X., Liu, L., Wang, Y., Wang, X., Ma, Y., & Li, Y. (2014). The Study on the factors affecting transformation efficiency of E. coli competent cells. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 27(3 Suppl), 679–684. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24816699/

Sharma, R. C., & Schimke, R. T. (1996). Preparation of Electro-Competent E. coli Using Salt-Free Growth Medium. BioTechniques, 20(1), 42–44. https://doi.org/10.2144/96201bm08.



Escrito por: Tyasning Kroemer, Ph.D.

Traducido por: Adriana Gallego, Ph.D.